Seahorse 糖酵解压力测试实验方案：从原理到实操的完整指南

糖酵解压力测试（Glyco Stress Test）是 Seahorse XF 平台除线粒体压力测试之外的另一项核心检测方案，通过顺序注射葡萄糖、寡霉素和 2-脱氧葡萄糖（2-DG），可以全面评估细胞的糖酵解功能及其对线粒体 ATP 合成的依赖程度。 一、实验原理 糖酵解压力测试利用三种关键药物揭示细胞能量代谢的调控关系： 第一步注射葡萄糖（10-25 mM）：为细胞提供外源性葡萄糖底物，刺激糖酵解通量增加。ECAR 的升高幅度反映细胞利用葡萄糖进行糖酵解的潜力。 第二步注射寡霉素（1-2 μM）：抑制线粒体 ATP 合酶（复合物 V），迫使细胞完全依赖糖酵解产生 ATP。此时 ECAR 达到峰值，反映细胞的最大糖酵解能力。 第三步注射 2-脱氧葡萄糖（50-100 mM）：2-DG 作为葡萄糖类似物竞争性抑制己糖激酶，完全阻断糖酵解通路。ECAR 的急剧下降验证了前两步检测到的信号确实来源于糖酵解。 二、关键参数解读 通过糖酵解压力测试可以获得以下关键参数： 1. 基础糖酵解率（Basal Glycolysis）：注射葡萄糖前的 ECAR，反映细胞在基础条件下的糖酵解水平。 2. 糖酵解能力（Glycolytic Capacity）：注射寡霉素后的 ECAR 峰值减去基础 ECAR，反映细胞的最大糖酵解潜力。 3. 糖酵解储备（Glycolytic Reserve）：糖酵解能力减去基础糖酵解率，反映细胞应对能量需求增加的糖酵解代偿能力。 4. 非糖酵解酸化率（Non-Glycolytic Acidification）：注射 2-DG 后的残余 ECAR，反映乳酸以外的酸化来源（如 CO₂ 水合、TCA 循环中间产物等）。 三、浓度优化建议 葡萄糖浓度：多数细胞系使用 25 mM 即可获得饱和响应，但部分高糖酵解细胞可能需要更高浓度。建议预实验设置 10、25、50 mM 三个梯度。 寡霉素浓度：浓度过低无法完全抑制线粒体 ATP 合酶，过高可能导致细胞毒性。推荐起始浓度为 1.5 μM，部分原代细胞可能需要 0.5-1.0 μM。 2-DG 浓度：50 mM 通常足以完全阻断糖酵解，但对某些高糖酵解肿瘤细胞系可能需要 100 mM。 四、数据归一化与质控 糖酵测压力测试的数据归一化方法与线粒体压力测试相同，推荐使用总蛋白定量法。质控方面需关注：2-DG 注射后 ECAR 是否降至基线以下（验证糖酵解完全阻断）、寡霉素注射后 ECAR 是否出现异常下降（提示细胞毒性）、孔间 CV 是否低于 15%。 五、典型应用场景 糖酵测压力测试广泛应用于以下研究方向：肿瘤细胞 Warburg 效应研究、免疫细胞激活后的代谢转换、药物对细胞糖酵解的抑制效应评估、代谢性疾病中的胰岛素信号通路研究等。 海普诺技术团队已建立标准化的糖酵解压力测试操作流程，欢迎联系获取详细技术文档。